Il DNA dell’olio. Cose da sapere

Docente presso il Dipartimento di Scienze del suolo, della pianta e degli alimenti dell’Università degli studi di Bari, Antonella Pasqualone segue le principali filiere alimentari mirando alla verifica della qualità e della tipicità dei prodotti, anche mediante la messa a punto di metodi innovativi quali l’analisi del DNA.

Membro dell’Associazione italiana per la scienza e tecnologia dei cereali (AISTEC) e della Società italiana di genetica agraria (SIGA), fa parte anche del Groupe international polyphenols, oltre a essere socio fondatore della Società italiana di scienza e tecnologia alimentare (SISTAL).

Non potevamo che rivolgerci a lei per approfondire il tema del DNA dell’olio da olive. La professoressa Pasqualone è tra l’altro referee per numerose riviste scientifiche internazionali e ha prodotto complessivamente oltre 150 pubblicazioni, molte delle quali comparse su riviste internazionali referenziate.

Professoressa, cosa ne pensa dell’esame del DNA come tecnica per certificare la/le cultivar presenti in un olio di oliva (sia in caso di olio ottenuto da monocultivar che in caso di blend), è un metodo affidabile e riproducibile o attualmente sussistono ancora dei limiti?
L’esame del DNA può essere impiegato con successo nell’identificazione delle cultivar presenti in olio di oliva, come dimostrato da numerosi studi condotti a livello nazionale e internazionale. L’analisi è sicuramente più semplice nel caso di oli monocultivar. Per quanto riguarda gli oli derivanti da miscele varietali, l’analisi del DNA è stata impiegata efficacemente nella verifica dell’autenticità degli oli DOP “Collina di Brindisi” e “Terra di Bari”. Negli oli multi-cultivar, comunque, la possibile sovrapposizione di profili di cultivar diverse, o fenomeni di amplificazione differenziale, possono interferire con una corretta interpretazione del pattern. Perciò, tutti gli studi concordano nel consigliare sempre un’accurata selezione preliminare dei marcatori molecolari da utilizzare. Va comunque considerato che nella maggior parte dei casi non viene richiesto di identificare il contributo di ogni singola cultivar all’olio in esame, bensì di evidenziare solo l’eventuale assenza di una cultivar dichiarata in etichetta o la presenza di una non prevista dal disciplinare, il che semplifica l’analisi.
Riguardo i possibili limiti, alcuni studi hanno riportato che il profilo genetico dell’olio può talvolta presentare degli alleli addizionali rispetto al profilo della cultivar di partenza. Questo fenomeno è stato attribuito al possibile contributo genetico da parte di altre cultivar presenti in campo, data l’autoincompatibilità della maggior parte delle cultivar di olivo e l’elevato polimorfismo dei marcatori scelti. Ad ogni modo, è stato già proposto di impiegare marcatori cloroplastici che, essendo ereditati per via materna, non presentano questo possibile inconveniente, oltre a essere più resistenti alle degradazioni nucleasiche e a essere presenti in un elevato numero di copie per cellula, caratteristiche tutte che risultano molto utili nell’analisi di DNA degradato e scarso come quello dell’olio.
Inoltre, studi mirati sui vari areali DOP, dove vengono prodotti gli oli per i quali sono più sentite le esigenze di verifiche varietali rispetto a quanto previsto dai disciplinari di produzione, potrebbero fornire un quadro più esaustivo permettendo di realizzare un data-base dei profili genetici degli oli DOP da usare come riferimento, così come attualmente esistono data-base dei profili genetici delle singole cultivar.
Sempre riguardo i possibili limiti, sebbene siano già stati messi a punto numerosi metodi per l’estrazione del DNA dall’olio, questa fase iniziale dell’analisi del DNA è oggetto di interesse in quanto vi è ancora margine di miglioramento. Per esempio, studi recentissimi hanno proposto di purificare selettivamente i frammenti di DNA meno degradati mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio e successiva elettro-eluizione, mentre un’altra strategia ha proposto di evitare del tutto l’estrazione del DNA e di effettuare le analisi direttamente sull’olio impiegando una DNA polimerasi altamente tollerante nei confronti dei PCR-inibitori. Quindi, in sintesi, l’esame del DNA è in realtà un insieme dinamico di tecniche diverse che, pur essendo già efficaci, sono comunque soggette ad approfondimenti e aggiornamenti che riflettono i progressi delle discipline da cui derivano e che ne consentono un miglioramento continuo.

Supposto che il metodo sia valido, che certezze ci sono sulla procedura con cui sono stati ricavati i marcatori di riferimento e caratteristici delle cultivar italiane e del bacino del mediterraneo?
Ricordiamo che l’idea di mettere a punto l’analisi del DNA nell’olio è nata dalla necessità di individuare un’efficace tecnica di identificazione delle cultivar impiegate, che non risentisse di quelle fluttuazioni dei parametri chimico-fisici del prodotto imputabili alla tecnologia di produzione e, prima ancora, alle tecniche agronomiche e alle condizioni pedo-climatiche. Il DNA, infatti, è un analita indipendente dall’influenza ambientale. Ad oggi, pertanto, gli studi condotti su questo tema sono piuttosto numerosi e praticamente tutte le classi di marcatori molecolari sono state utilizzate per la rintracciabilità varietale dell’olio d’oliva: i RAPD (randomly amplified polymorphic DNA), gli ISSR (inter-simple sequence repeat), gli AFLP (amplified fragment length polymorphism), i microsatelliti, gli SCAR (sequence-characterised amplified region) e gli SNP (single nucleotide polymorphism), pur se con una netta prevalenza dei microsatelliti (impiegati in 21 casi su 35 ricerche censite dal 1996 al 2015) e degli SNP (usati in 6 studi su 35), in virtù della loro maggiore riproducibilità.
Inoltre, negli ultimi anni si è assistito al rapido sviluppo di metodi di genotipizzazione automatizzabili, applicabili proprio all’analisi dei microsatelliti e degli SNP, come l’HRM (high resolution melting) e la tecnologia DART (diversity arrays technology), che hanno ridotto i tempi dell’analisi e aperto nuove prospettive di ricerca permettendo di analizzare un elevato numero di marcatori in numerosi campioni.
Quindi, anche se più che di “certezze” è sempre più opportuno parlare di elevati livelli di probabilità, le procedure con cui sono stati ricavati i marcatori di riferimento, che appartengono soprattutto alla categoria dei microsatelliti e degli SNP, sono frutto del lavoro di numerosi laboratori e gruppi di ricerca, il che le rende ben collaudate e attendibili. In alcuni casi i marcatori stessi sono stati condivisi e sperimentati da laboratori diversi, che ne hanno proprio definito una “consensus list” volontaria, cioè una lista di marcatori selezionati tenendo conto principalmente della riproducibilità e della chiarezza del pattern di amplificazione. Questi marcatori sono stati impiegati per caratterizzare le principali cultivar italiane ed estere, conservate presso le varie collezioni varietali di riferimento presenti nel bacino del Mediterraneo, generando dei data-base utili per le comparazioni successive.

La banca data di tali marcatori è attendibile?
Come già detto, ad oggi studi esaustivi sono stati condotti da numerosi gruppi di ricerca su un elevato numero di cultivar di olivo con un altrettanto elevato numero di marcatori. Ciò ha consentito di accumulare numerose informazioni genetiche. Proprio tale numerosità consente di rendere attendibile, con elevata probabilità, l’identificazione di una cultivar basata sul confronto con un profilo di riferimento.

E’ condivisa tale banca dati? Oppure ognuno dispone della propria?
Tutti i dati sono sempre condivisi, nel senso che sono pubblicamente accessibili, in quanto ogni gruppo di ricerca pubblica su riviste internazionali i risultati degli studi condotti. Inoltre, esiste l’OLEA data-base (QUI), che raccoglie i dati generati da gruppi di ricerca diversi mediante l’analisi dei microsatelliti delle varie cultivar.

L’olio sul quale sono state effettuate le prove di estrazione del DNA e quindi in seguito l’individuazione delle cultivar di origine proviene da tecniche di trasformazione eseguite in laboratorio?
Nei vari studi condotti sono stati analizzati sia campioni prodotti in laboratorio sia campioni prelevati in frantoio. Non sono state osservate differenze nell’efficacia dell’analisi che, anzi, in alcuni casi ha evidenziato un’errata attribuzione varietale dei campioni commerciali.

In questo caso, questa metodica di trasformazione può essere paragonabile a quella di un frantoio reale, dotata per esempio di avanzati sistemi di filtrazione che potrebbero rendere complicata l’estrazione del DNA?
Gli oli prodotti in laboratorio, talvolta anche filtrati, sono serviti nella maggior parte degli studi per la messa a punto delle metodiche analitiche su campioni di provenienza varietale certa, ma anche quando sono stati considerati gli oli commerciali, filtrati industrialmente, le analisi hanno avuto un andamento regolare, senza falsi negativi, dimostrando una sostanziale equivalenza delle tecniche produttive dal punto di vista dell’analisi del DNA. I numerosi studi volti a definire l’influenza delle varie fasi del processo produttivo dell’olio sulla quantità e sull’integrità del DNA residuale e, quindi, sulla sua idoneità all’analisi, hanno evidenziato che la frangitura, la gramolatura o anche l’eventuale denocciolatura contribuiscono alla degradazione meccanica del DNA e che le centrifugazioni finali e, soprattutto, la filtrazione sono responsabili di una forte diminuzione quantitativa. Tuttavia, tracce di DNA permangono anche negli oli filtrati, sufficienti a condurre l’analisi grazie all’elevata sensibilità della PCR, posto che si ricerchino sequenze bersaglio di piccole dimensioni. Uno studio recente condotto su campioni industriali ha dimostrato che neanche l’impiego del talco micronizzato, un coadiuvante spesso impiegato in frantoio per aumentare le rese olearie, il cui effetto adsorbente si era ipotizzato agire negativamente sul DNA, inficia in realtà l’applicabilità dell’analisi dei marcatori molecolari all’olio.
Altri studi hanno preso in considerazione il tempo e le modalità di conservazione dell’olio osservando, nella maggior parte dei casi, che l’analisi del DNA rimane efficace finché l’olio non si ossida eccessivamente, condizione che di per sé renderebbe comunque poco sensata l’applicazione di una tecnica così sofisticata, più idonea alla verifica varietale di campioni di eccellente qualità.
E’ interessante notare, infine, che i metodi di analisi del DNA dell’olio possono essere efficacemente impiegati anche per la verifica dell’identità varietale delle olive da mensa, focalizzando l’attenzione su quelle produzioni aventi maggior valore aggiunto quali le DOP. A tal proposito, le olive da mensa DOP “Bella della Daunia”, “Nocellara del Belice” e “Ascolana del Piceno” sono già state oggetto di studi specifici, che hanno dimostrato che i trattamenti di deamarizzazione con salamoia o con sale secco non inficiano l’analizzabilità del DNA.

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La foto di apertura è di Lorenzo Cerretani

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